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猪尿中克伦特罗检测方法—酶联免疫吸附测定法(摘自农牧发[2001]38号)

时间:2018-11-13 13:08:17来源:food栏目:检验技术 阅读:

猪尿中克伦特罗检测方法—酶联免疫吸附测定法

前言

克伦特罗为β—肾上腺素受体激动药,是一种用于人治疗哮喘、支气管痉挛的药物。研究发现在饲料中添加克伦特罗可促进动物生长、提高瘦肉率,特别是改进脂肪型动物的肉与脂肪的比例,猪饲用后生长速度快,体型好,且瘦肉多、脂肪少,被当作“瘦肉精”而成为一些饲料生产企业和养猪户的“秘密武器”。但是克伦特罗进入猪体内后,主要分布在肝等内脏器官,在体内代谢的时间较长,容易造成药物在组织中残留,给消费者带来危害;健康的人在食用一定量的残留有克伦特罗的猪肉或内脏后,可能出现肌肉震颤、心慌、战栗、恶心、代谢紊乱、呼吸急促、烦躁不安等症状。由于克伦特罗的性质稳定,能够在猪尿中以原形排出,因此制订猪尿中克伦特罗的检测方法,以监测“瘦肉精”的使用,显得非常重要。

竞争酶标免疫法是非常有效的筛选方法,可定量测定尿、肌肉、肝脏及牛眼中的克伦特罗。此法快速简便、经济实用,较易掌握推广。

本标准由江西省农业厅提出。

本标准由江西省兽药饲料监察所负责起草。

本标准起草人:刘安南、陈文云、万文根、徐国茂。

猪尿中克伦特罗检测方法—酶联免疫吸附测定法

1 范围

本标准规定了猪尿中克伦特罗检验的制样和酶联免疫吸附测定方法。

本标准适用于猪尿中克伦特罗的残留常规快速筛选及定量检测。

2 测定方法

2.1 原理与方法

测定的基础是抗原抗体反应。酶联板包被有克伦特罗特异性抗体的抗体,加入抗克伦特罗的特异性抗体,两者结合被固定。标样或试样中克伦特罗与酶(辣根过氧化酶)标记抗原竞争抗克伦特罗的特异性抗体。通过洗涤以除去没有与抗克伦特罗的特异性抗体结合的酶标记抗原。加入酶基质(过氧化尿素)和发色剂(四甲基联苯胺)结合到酶联板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450nm处测定吸光度值。吸光度值与样品中的克伦特罗浓度成反比。

2.2 试剂、用途及仪器、设备

竞争酶标免疫法试剂盒可用于定量测定尿、肌肉、肝脏等中的克伦特罗。试剂盒中包括了所有检测用的试剂,在使用前,请详细阅读试剂盒说明书。定量分析须用微孔板酶标仪(450nm)进行测量。

2.2.1 克伦特罗系列标准溶液(0ng/L,100 ng/L,300 ng/L,900 ng/L,2700 ng/L,8100 ng/L)

2.2.2 酶标板

2.2.3 抗克伦特罗的特异性抗体

2.2.4 酶标记抗原

2.2.5 缓冲溶液

2.2.6 酶基质/发色剂

2.2.7 反应停止液(1mol/LH2SO4)

2.2.8 微孔板酶标仪(450nm)

2.2.9离心机

2.2.10微型振荡器

2.2.11 微量加样器(20μl,50μl,100μl,200μl,250μl)

3 制样

3.1 样品的制备

取适量新鲜或冷冻空白或供试尿液,如尿样浑浊,则必须2000g离心10min,取上清液留用。

3.2 样品的保存

-20℃冰箱中贮存备用。

3.3 测定

测定之前将所有试剂回升至室温20℃—24℃,取解冻后的供试样品,2000g离心10min,取上清液,作为供试液。

3.3.1 测定程序(室温20℃—24℃条件下操作)

(1)将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准和样品做两个平行实验,记录下标准和样品的位置。

(2)加入100μl稀释后的抗体溶液到每一个微孔中底部,在室温孵育15min。

(3)倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打3次),以保证完全除去孔中的液体,用250μl蒸馏水充入孔中,再次倒掉微孔中液体,重复操作两遍以上。

(4)精密吸取20μl标准溶液及处理好的样品到各自的微孔中,标准和样品做两个平行实验。

(5)加入100μl稀释的酶标记物到微孔底部,在微型震荡器上混匀,室温孵育30min。

(6)重复步骤(3)。

(7)加入100μl基质/发色剂到微孔中,在微量振荡器上充分混匀(或小心地在平面上转动酶标板以充分混合),并在室温暗处孵育15min。

(8)加入100μl反应停止液到微孔中,混匀。在60min内450nm处以空气为空白测定吸光度值。

3.3.2 结果判定和表述

按下式计算百分吸光度值:

百分吸光度值=B/B0×100%

式中:B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值;

B0—为零标准的标准溶液平均吸光度值;

以X轴为标准溶液中克伦特罗浓度(ng/L)的自然对数,Y轴为百分吸光度值,在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。从标准曲线上查出供试样品中克伦特罗的浓度(ng/L)。也可以用专业计算机软件求出供试样品中克伦特罗的浓度。

检测结果小于1000ng/L时判为未检出,大于或等于1000ng/Lg时判为可疑,需要复检后再确定。复检后小于或等于1000ng/L为未检出,大于1000ng/L为阳性。尿液稀释系数为1。

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