北京市营养源研究所科威华公司王珂 温凯李东 100054

食物过敏原可以定义为包含在食物中引发或激起过敏反应的物质，在Ⅰ型IgE应激的过敏反应中，过敏原通常是在特定食品中含有的含量丰富、天然存在的蛋白质。 随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品过敏问题具有更大的潜在危险性，因此建立可靠、定量的过敏原检测方法对于确保食品标签的一致性和消费者的安全十分必要。然而因为食物过敏原在食品中的含量少以及可能被食品基质包裹等原因，食物过敏原的生物活性的检测十分困难，另一个检测问题是检测方法的灵敏度，一般来说，不同食物中检测极限要求在1—100ppm（每kg食物中含mg量级过敏性蛋白）。 几乎所有的过敏原（抗原）都是蛋白质或多肽类物质，多肽分子量一般在5-70KDa之间，也有一些过敏原分子量超过200KDa以上。某种食物或食物制品是否存在致敏性，通常是依据确诊敏感个体血清中键合的IgE来判断，一旦过敏原可以确认和纯化，就可以在兔子、老鼠、山羊、绵羊或鸡这些动物中获取抗体，为常规食品分析提供免疫检测方法。 现在，检测食物成品中潜在过敏原有几种技术上的可能性，采用的方法包括直接检测过敏原（蛋白质）自身或检测引起食物过敏可能的标志物，如果理想的标志物就是过敏原蛋白，其化学特性不能很好表达或检测极限达不到要求，则检测过敏原不可行。另外，许多致敏食物中包括多种过敏原蛋白，含量也有所不同。作为潜在过敏食物制品或成分的标记物，特定的蛋白质或DNA片段可以作为靶记进行检测。以检测蛋白为基础的方法通常包括免疫化学检测方法，例如RAST(radio-allergosorbent test)、EAST（enzyme allergosorbent test）、RIE（rocket immuno-electrophoresis）、免疫印迹（immunoblotting）和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）。其中RIE和免疫印迹方法是定性和半定量方法，RAST、EAST和ELISA是定量分析方法。现在只有ELISA法因其准确性高、易操作和标准化的可能性等，在常规食品分析中常用。DNA水平上的测试方法是依照多聚酶联反应（PCR）来识别特定的DNA片段，实时（real-time）PCR方法可以得到高精确度的检测结果。 检测方法的选择主要考虑所测试的食品特性（有无可检测的特定抗体或DNA以及可达到的检测极限）以及食品制造过程的加工历史等。以蛋白或DNA为基础的检测方法，不同的食物成品的检出和定量检测上有各自的优、缺点。对于以DNA为检测对象的过敏原检测有不同争议，因为蛋白质是过敏原成分而加工过程会对蛋白、核酸等产生不同影响。 下面就几种常用的检测和定量方法进行讨论： RAST/EAST (radio-allergosorbent test/enzyme allergosorbent test） RAST/EAST主要应用于食物过敏的临床诊断，同时也应用于食物过敏原的定性检出以及多品种食物中潜在致敏性的评价。也有少量使用RAST法进行过敏原的定量检测的文献报道，检测限为1mgkg-1。RAST或EAST的检测原理是抗原或过敏原在固定相上与特定的人类抗体IgE键合，样品中的抗原与固定相上的抗原竞争键合IgE，一种抗IgE的抗体用同位素（）或酶（，如过氧化物酶）标记，加入可以改变颜色或能发光的底物用来检测键合IgE的抗体量，键合的IgE用γ-计数器或分光光度计来定量检测。此两种方法的最大缺点是无法获取过敏人群的血清以及评价方法的标准化困难。 RIE （rocket immuno-electrophoresis） RIE使用含有凝胶的抗体，被分析的抗原按照自身的电泳能力在凝胶中移动直到抗体和抗原结合，所形成的电泳峰高与检测抗原量成比例。RIE法检测不同食品中的几种抗原的检测极限约为2.5-30 mgkg-1。该方法的局限是实验所需的凝胶制备和免疫环节的操作程序比较复杂。 免疫印迹（IB） （immunoblotting） 点式免疫印迹测试法主要用于简单或廉价食品样品的检测，提取的样品蛋白喷洒在硝化纤维膜或PVPF膜上，用特定的与目标抗原结合的抗体进行酶标记，酶与底物反应呈现出有颜色的斑点，斑点的深浅与抗原的含量成比例。这种方法是半定量测量方法，但对某些食物（如花生）中的蛋白检出限可达到2.5 mgkg-1。 ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay） 现在ELISA是食品工业和政府食品管理部门进行食品中潜在过敏原检测和定性最常用的方法，用这种方法特定的蛋白或抗原可以与特定的酶标记的抗体键合后用显色反应来定性和定量，靠标准曲线来计算抗原的含量。 ELISA的检测方式有两种：竞争式（competitive）ELISA法和夹心式（sandwich）ELISA法，后者是最常用的食物过敏原的免疫评价方法。 夹心式ELISA方法是用固定在固定相上的捕获抗体，样品中特定的蛋白被第一个抗体捕获，然后被第二个特定的以酶标记的抗体检出，而第二个抗体与被分析物键合，从而形成夹心式。与第二个抗体相连的酶与特定的底物反应形成有颜色的产物，它的吸收峰与被分析物的浓度线性相关。此种方法用于多种食物过敏原的检测，有多种检测工具包上市。 竞争式ELISA方法是测定相对较小蛋白质优先选择的方法。它包含一个键合在固定相上的固定抗原，血清和一定比例稀释样品提取物（作为抑制剂）培养后添加到固相抗原上。如果样品中没有抗原出现，酶标记的抗体表现出与固定相上键合的抗原的最大键合能力，形成的有颜色的产物的最大吸收。因为样品中的抗体抑制酶标记的抗体与固定的抗原的键合，吸收峰与样品中抗原的浓度成反比。有报道，使用竞争式ELISA方法对某些食物过敏原的检测极限可以低至0.4μg kg-1。 纤维素试纸测试 纤维素试纸测评是近年来发展起来可以代替ELISA方法的一种测试方法，它具有价格低、快速、方便携带、无须仪器设备、操作简便等特点。目前，试纸测试只是定性方法，有改进的用于测定鸡蛋中过敏原的试纸测定方法，具有高度的专一性和灵敏度，检测限低至0.02 mgkg-1。 PCR多聚酶联反应 以DNA为测试对象的检测方法越来越多地应用到外来食物的检测中，如转基因谷物等。PCR方法对食物中特定过敏原的检测具有专一性和灵敏度，但是，PCR方法不能检测抗原或特定蛋白，因此检测结果不能与食物的真正过敏性相关联，而且食品加工过程对蛋白和DNA的影响不同，在一些加工工序中蛋白和DNA可能被分离，因此产品中是否有过敏原，以PCR方法的检测结果作判断可能产生错误结论。PCR方法的优点在于，以DNA为测试对象的方法与以蛋白质为测试对象的方法相比，热变性条件下目标DNA可以有效提取而不象蛋白提取时受食物基质的影响较大；它的另一个优点是它的稳定性，它不象蛋白质组成那样受地理条件和季节变化的影响。 特定的DNA片段，侧链连接两个被热稳定的多聚酶化学修饰的低聚核苷酸作为测定反应的初始物，测定反应每一个修饰循环包括三个作用步骤。 普通PCR方法测试结果只是定性方法，然而选择合适的内标物，可以进行半定量分析测定，更好的定量方法可以使用即时（real-time）PCR方法或PCR-ELISA联用方法。 即时PCR方法与其他DNA定量方法相比，即时PCR方法需要昂贵的实验室设备，但准确度高，劳动强度低。即时PCR方法不用凝胶制品而使用特定目标的低聚核苷酸探子，因而实现即时分析。 PCR-ELISA联用方法是用特定的以DNA为基础的方法与相当方便和经济的ELISA测定方法结合用于半定量分析的分析方法。使用PCR-ELISA联用方法，致敏食物中特定的DNA片段被化学修饰，修饰物与特定的DNA探子标记的特定蛋白相结合，标记蛋白与特定的酶标记的抗体偶合，以酶-底物反应形成的颜色反应来定量测定DNA的浓度。 生物探测器 使用生物探测器是另一项还未普及应用到食品分析中的技术。生物探测器仪器可以即时测定特定分子之间的反应。把一个目标分子（可能是抗体（蛋白）或DNA片段）固定到传感器的表面，然后定量测定一个或两个分子间的键合反应。这种技术的特点是分析时间短、自动化程度高。生物探测器技术可以用来测定特定的蛋白质或过敏原，也可以用于测定特定的DNA片段。该技术已用于榛子、鸡蛋和牛奶中过敏原的检测。

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