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金黄色葡萄球菌的检验

时间:2018-11-27 16:11:40来源:food栏目:检验技术 阅读:

食品伙伴网注:本方法源自奶牛乳房炎防治技术指南(试行)(农医发[20l0]29号)

1主要试剂和试验方法:

1.1革兰氏染色:

1.1.1涂片、火焰固定。

1.1.2草酸铵结晶紫染1min。

草酸铵结晶紫染液的配制:

溶液A:结晶紫2g,95%酒精20mL,溶液B:草酸铵0.8g,蒸馏水80mL。将A、B溶液混合,用滤纸过滤后即可使用。

1.1.3自来水冲洗。

1.1.4加碘液覆盖涂面染约1min。

1.1.5水洗,用吸水纸吸去水分。

1.1.6加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,20s后水洗,吸去水分。

1.1.7沙黄液(稀)染2min后,自来水冲洗。干燥,镜检。

革兰氏阳性菌染色为蓝色,革兰氏阴性菌染色为红色。

1.2触酶试验:取槽置于洁净的试管内或玻片上,然后加3%过氧化氢数滴;或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中,立即观察结果。有大量气泡产生者为阳性,无则为阴性。

1.3血浆凝固酶试验:吸取0.5mI。兔血浆与0.5mlj金黄色葡萄球菌浸液肉汤24h培养物充分混匀,置36±1℃培养,每隔半小时观察一次,连续观察6h,出现凝固,即将小试管倾斜或倒置时,内容物不流动,判为阳性。同时做阴阳性对照。

2乳样的采集

选取出现临床症状(或者怀疑为亚临床型乳房炎)乳房炎奶牛,先用温水,再用0.2%新洁尔灭擦洗乳房,最后用70%的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头2-3把奶,以排除污染的杂菌,每头奶牛取乳样5mI.于无菌乳样杯中,待检。

3病原菌的分离培养

初步诊断:将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为葡萄球菌。

分离培养:将乳样摇匀,分别取适量接种于营养肉汤(10%血清)、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基(平板)后,置于37℃温箱培养24~48h。观察每个平板中细菌生长的情况,记录菌落生长表现。

普通琼脂平板上,37℃,24~72h培养后,可见到湿润、光滑、隆起的圆形金黄色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、镜检(镜检呈葡萄状排列,无芽胞、荚膜,直径0.5~lμm,革兰氏染色阳性),并挑取单个可疑菌落移植于肉汤和斜面培养基,经37℃培养24~48h。24h后没有长菌的平板,再用相应的增菌肉汤涂划一次,继续培养,24~48h后,再作检查,以防漏检。将剩余的乳样存放于4℃冰箱内备用。

营养肉汤中呈浑浊生长,管底有少量灰白色沉淀;

血液琼脂平板中菌落较大,呈金黄色、圆形,周围出现明显的β-溶血。

4生化鉴定

触酶试验:触酶阳性

血浆凝固酶试验:凝固酶试验阳性

糖发酵试验:能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖

色素产生情况:能产生金黄色色素

5毒力试验

将上述经过生化试验鉴定的细菌悬液用灭菌生理盐水作适当稀释,对随机分组的小鼠进行腹腔注射接种,接种量为0.5mL/只(家兔皮下接种1.0mL或者静脉接种0.1~0.5mL),能够致死动物或者内脏出现脓肿可以确定有毒力。

6病原菌的重分离试验

对接种后发病、死亡小鼠(家兔)的肝脏进行病原菌重分离。进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查,观察所分离菌株是否为原接种菌。如果是则进一步确定病原菌为金黄色葡萄球菌。

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