一.荧光强度与溶液浓度的关系

荧光是由物质吸收光能后发射而出，因此，溶液的荧光强度 F 和溶液吸收光能的程度以及物质的荧光频率有关：

F ∝（I₀-I_t）→ F = K^’（I₀-I_t） (2)

K^’ 为常数，取决于荧光物质的量子效率F，根据L—B定律：

所以 F = K’ ( I₀-I₀10^-ebc) = K’ I₀ ( 1-10^-ebc) = K’ I₀ ( 1-e^-2.303ebc ) (3)

将式中 e^-2.303ebc 展开，得

(4)

当 2.303ebC£ 0.05 时(浓度很小，溶液较稀时)，上式括号内第一项以后的各项均可忽略不计，所以：

F = K’I₀2.303ebc （5）

对于一荧光物质的稀溶液，当 I₀ 及 b 一定时，

F=K·c （6）

即在低浓度（2.303ebc £ 0.05）时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈（线性）正比关系。

二. 定量分析方法

1. 工作曲线法：

配制一系列浓度梯度的待测物的标准溶液，同空白溶液，使样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：F_s、F₀、F_x，然后作（ F_s - F₀）— c 曲线，根据（F_x–F₀)，从工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。

2. 直接比较法 ：

如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选择其线性范围，用直接比较法进行测定：

F_s¯F₀ = Kc_{S ，} F_x¯F₀ = Kc_x （7）

三. 影响荧光强度的外界因素

1. 激发光源：一般选用l_ex 最大

但对某些易感光、易分解的荧光物质，尽量采用长波长，低 I₀ 及短时间光照

2. 温度：大多数分子在温度升高时，分子与分子之间，分子与溶剂分子之间的碰撞频率升高，非辐射能量转移过程升高，F 降低，因此，降低温度，有利于提高 F 。

3. 溶液的 pH：带有酸性或碱性环状取代基的芳香组化合物的荧光一般都与 pH 值有关，有些化合物在离子状态时不显荧光。为此，在用荧光强度进行定量测定时，严格控制溶液 pH值是非常重要的。

4. 溶剂：对π

—π共轭的荧光物质

在极性溶剂中，∆E 减小↓→ 跃迁几率升高↑ → F↑（波长长移）

溶剂粘度 ↓ → F↓

5. 内滤：当荧光波长与荧光物质或其它物质的吸收峰相重叠时，将发生自吸收使荧光物质的荧光强度下降，此现象称 “内滤” 。

6. 散射光的影响（溶剂的二种散射）

（1）瑞利散射光：物质（溶剂或其它分子）分子吸收光能后，跃迁到基态的较高振动能级，在极短时间（10^-12s）返回到原来的振动能级并发出和原来吸收光相同波长的光，这种光称为瑞利散射光。

（2）拉曼散射光：物质分子吸收光能后，若电子返回到比原来能极稍高（或稍低）的振动能级而发射的光称为拉曼散射光。

瑞利散射光波长与激发光波长相同，拉曼散射与激发光波长不同，而荧光物质的荧光波长与激发光波长无关，因此可以通过选择适当的激发波长将拉曼散射光与荧光分开。

7. 荧光熄灭剂的影响：

荧光熄灭：荧光物质分子与溶液中其它物质分子之间作用导致荧光强度降低的现象。

荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。

如：X^-，重金属离子、O₂ 、硝基化物质、重氮化合物等。

尤其是溶液中的溶解氧能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭现象，因此，在较严格的荧光实验中必须除O₂ 。

8. 表面活性剂的影响：提高荧光强度。

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